科研 | Front Oncol：基于核磁共振代谢组学分析二甲双胍治疗胆管癌细胞的抗癌作用（国人佳作）

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编译：微科盟阿温，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读二甲双胍是一种广泛使用的抗糖尿病药物，具有潜在的癌症治疗效用。一些研究表明二甲双胍与降低胆管癌（CCA）的风险有关，强调了二甲双胍治疗CCA的潜力。然而，潜在的分子机制仍然难以捉摸。在此，我们证明二甲双胍治疗可以剂量依赖性地抑制人CCA细胞系Mz-ChA-1和QBC939的增殖。基于核磁共振代谢组学分析显示，二甲双胍治疗组（Met）和对照组（Ctrl）的CCA细胞有明显的区别。我们结合1D-¹H-NMR波谱数据的多元统计分析和代谢物水平的配对t检验，确定了特征代谢物。然后，我们根据特征代谢产物确定了四种显著改变的代谢途径，包括葡萄糖代谢、氧化应激相关代谢、能量代谢和氨基酸代谢。将CCA细胞与正常人脐静脉内皮细胞（HUVECs）进行比较，我们发现二甲双胍治疗显著促进糖酵解，并特异性增加BCAAs和UDP-GlcNAc的水平，暗示二甲双胍治疗的CAA细胞发生自噬和细胞周期阻滞。本研究为二甲双胍对CAA细胞的抗癌作用提供了一个机制性的认识，有助于二甲双胍作为一种抗癌药物的进一步开发。

论文ID

原名：Nuclear Magnetic Resonance-Based Metabolomic Analysis of the Anticancer Effect of Metformin Treatment on Cholangiocarcinoma Cells译名：基于核磁共振代谢组学分析二甲双胍治疗胆管癌细胞的抗癌作用
期刊：Frontiers in Oncology
IF：4.848发表时间：2020.11通讯作者：李文岗、林东海
通讯作者单位：厦门大学

实验设计

1. MTS分析和克隆形成实验验证二甲双胍抑制细胞增殖的效率；

2. 基于NMR的代谢组学分析二甲双胍治疗后的代谢差异；

3. 鉴定代谢物，对特征代谢物进行代谢途径富集分析；

4. 最后评估二甲双胍对正常HUVEC细胞中四个主要代谢途径簇中代谢物的水平变化。

实验结果

1. 二甲双胍以剂量依赖性方式抑制两种CCA细胞的增殖
为了探讨二甲双胍对CCA的抗癌作用，我们对两种人CCA细胞（MZ-CHA-1和QBC939）进行了MTS分析和集落形成分析，用不同浓度的二甲双胍处理CCA细胞。MTS分析显示二甲双胍以剂量依赖的方式降低细胞存活率（图1A，B）。此外，当用0.5 mM二甲双胍处理两个CCA细胞48小时后，相对细胞存活率显著降低至80-90%。这样的处理使得MET组和Ctrl组之间的细胞数量差异小于10%。我们的初步实验表明，在48h收获两个CCA细胞提供了最大的代谢物浓度，实验误差较小。此外，在集落形成试验中，0.5或5 mM的二甲双胍显著降低了集落的能力（图1C-F）。因此，在以下基于核磁共振的代谢组学分析中，我们用二甲双胍处理两个CCA细胞48小时。图1 二甲双胍以剂量依赖的方式抑制两种人胆管癌细胞的增殖（A，B）MZ-ChA-1细胞（A）和QBC939细胞（B）与不同浓度二甲双胍孵育48小时后的相对存活率。（C，D）二甲双胍治疗前后MZ-ChA-1细胞（C）和QBC939细胞（D）的集落形成。（E，F）MZ-ChA-1细胞（E）和QBC939细胞（F）集落形成率的定量。
 2. 二甲双胍显著改变两种CCA细胞的代谢谱
为了揭示Met和Ctrl组之间的代谢差异，我们对来自两个CCA细胞的水提取物进行了基于NMR的代谢组学分析。典型的1D-¹H-NOESY光谱如图2所示。然后进行细胞代谢物的共振分配（表1），并通过2D ¹H-¹³CHSQC和2D ¹H-¹HTOCSY光谱进一步证实（图S1），共鉴定出41种代谢产物。对归一化核磁共振数据进行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法（PLS-DA）以评估二甲双胍治疗对CCA细胞代谢谱的影响。所有样本均位于95%置信区间的hotellings T2椭圆上。在PCA模型或PLS-DA模型的得分图中，每个点代表一个样本，点之间的距离反映了代谢差异的程度。PCA得分图显示Met-Mz和Met-939组分别与Ctrl-Mz和Ctrl-939组有明显的分离，表明二甲双胍治疗显著改变了两个CCA细胞的代谢谱（图3A，B）。PLS-DA评分图显示Met-Mz和Met-939组与Ctrl-Mz和Ctrl-939组的代谢分离得到改善（图S2A，B）。交叉验证图表明两个CCA细胞的PLS-DA模型的高可靠性（图S2C，D）。此外，我们进行了HCA分析，以确认PCA和PLS-DA模型的有效性（图S2E，F）。HCA的树状图说明Met Mz组形成一个单独的簇，而Ctrl Mz组属于另一个簇（图S2E）。QBC939细胞显示类似的HCA图（图S2F），这一结果很好地支持了PCA和PLS-DA的结果。表1 从两个CCA细胞的Met和Ctrl组中水提取物的1D-¹H-NMR谱鉴定的代谢物的共振分配 
图2 来自两个CCA细胞的二甲双胍治疗组和对照组的水代谢物的平均1D ¹H-NOESY光谱保留了1.0–4.6和5.2–9.0 ppm的光谱区域，去除了水区域（4.6–5.2 ppm）。将5.2–9.0 ppm的光谱区域缩放5次。Met-Mz和Met-939分别代表二甲双胍处理的Mz-ChA-1细胞组和二甲双胍处理的QBC939细胞组。Ctrl-Mz和Ctrl-939分别代表未经二甲双胍处理的Mz-ChA-1细胞组和QBC939细胞组。
 3. 二甲双胍深刻地改变了两种CCA细胞的代谢物水平
在PLS-DA模型的负荷图（图3C，D）中，红色、黄色和蓝色的变量分别非常显著、显著和不显著，向上或向下的方向表明Met组的变量比Ctrl组的变量上调或下调。与Ctrl-Mz和Ctrl-939相比，Met-Mz和Met-939组的二甲双胍水平显著升高，表明细胞外二甲双胍被转运到两个CCA细胞中。我们已鉴定出主要负责Met-Mz和Met-939组与Ctrl-Mz和Ctrl-939组的重要代谢物。二甲双胍处理后，Mz-ChA-1细胞中有14种代谢产物增加，18种代谢产物减少；QBC939细胞中有10种代谢产物增加，11种代谢产物减少。代谢物的相对水平用1D-¹H-NOESY谱的相对积分表示。使用单变量统计分析（成对student’s t-test检验）对Met-Mz和Ctrl-Mz组之间以及Met-939和Ctrl-939组之间代谢物的相对水平进行定量比较，如表2所示。有统计学意义（p<0.05）的代谢物被鉴定为差异代谢物。我们在Mz-ChA-1和QBC939细胞中分别共鉴定了33种和30种差异代谢物。 图3 从两个CCA细胞的Met和Ctrl基团的水提取物获得的核磁共振（NMR）光谱数据的多元统计分析（A，B）Met-Mz组与Ctrl-Mz组（A）和Met-939组与Ctrl-939组（B）的PCA得分曲线图；（C，D）偏最小二乘判别分析（PLS-DA）负荷曲线图，用于识别主要导致Met-Mz组与Ctrl-Mz组（C）以及Ctrl-939组与Met-939组（D）的代谢差异的重要代谢物。
 表2 根据1D核磁共振（NMR）谱计算的相对积分定量比较两个CCA细胞的Met和Ctrl组之间的代谢物水平 
4. 二甲双胍对两种胆管癌细胞代谢途径的影响相似
将鉴定出的差异代谢物与上述重要代谢物相结合，我们在Met-Mz和Met-939细胞中分别获得了32和29种与对照组相比的特征代谢物，然后对特征代谢物进行代谢途径富集分析。图4显示了前50个富集途径。Met-Mz细胞富集代谢途径的排序与Met-939细胞高度相似，显著性较高的代谢途径与葡萄糖代谢、氧化应激相关代谢、能量代谢和氨基酸代谢四大代谢途径簇密切相关。二甲双胍诱导涉及四个主要代谢途径中特征性代谢物，Met-Mz与Ctrl-Mz和Met-939对代谢物水平变化进行了量化，结果与Ctrl中大多数代谢物水平在两个CCA细胞中表现出一致的变化趋势。二甲双胍处理的CCA细胞显示丙酮酸、乳酸和NAD⁺水平上调，葡萄糖、GTP和TCA循环中间产物（2-酮戊醚；富马酸）水平下调。此外，在二甲双胍处理的CCA细胞中，大多数检测到的非必需氨基酸减少，一些检测到的必需氨基酸（蛋氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）有增加的趋势。这些结果表明二甲双胍治疗对两种CCA细胞系有相似的作用。 图4 二甲双胍对两种CCA细胞代谢途径的影响（A，B）基于MZ-ChA-1细胞（A）和QBC939细胞（B）中鉴定的特征代谢物的代谢物集富集分析得出的前50个代谢途径。
 5. 二甲双胍对胆管癌细胞某些代谢物水平的影响不同
为了证实二甲双胍治疗对CCA细胞的独特作用，我们进一步评估了二甲双胍诱导的正常HUVEC细胞中四个主要代谢途径簇中代谢物的水平变化（图5）。HUVEC细胞与两个CCA细胞共有几个代谢水平，包括乳酸水平升高，谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和b-丙氨酸水平降低。二甲双胍治疗后，CCA细胞葡萄糖、延胡索酸和丙氨酸显著降低，HUVEC细胞升高；CCA细胞NAD⁺、UDP-GlcNAc和BCAAs升高，HUVEC细胞降低或不变。为了观察二甲双胍治疗对CCA细胞代谢途径的影响，我们将特征代谢产物投影到代谢图上（图6）。主要改变的特征代谢产物和显著改变的代谢途径为二甲双胍治疗CCA细胞抗癌作用的分子机制提供了新的见解。 图5 二甲双胍治疗的MZ-ChA-1、QBC939和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的代谢物水平与未治疗对照组相比（A–C）参与葡萄糖代谢（A）、能量代谢和氧化应激相关代谢（B）以及氨基酸代谢（C）的代谢物。
 图6 二甲双胍治疗对CCA细胞代谢途径影响的示意图实线：直接转换；虚线：间接转换。在至少一个CCA细胞系（MZChA-1和/或QBC939细胞）中，红色、蓝色和黑色的代谢物分别代表二甲双胍治疗后的增加、减少和不变。1D-¹H-NMR谱未检测到以灰色显示的代谢物。绿色箭头和红色十字分别表示二甲双胍处理的CCA细胞相对于对照细胞的潜在促进和抑制代谢途径。
 

讨论

如前所述，二甲双胍通过有机阳离子转运蛋白（OTC）家族转运到肝细胞，尤其OTC1基因变异与二甲双胍治疗的疗效密切相关。在这项研究中，我们观察到甲双胍在两个CCA细胞中的累积，这意味着二甲双胍被转运到细胞中并显示出其作用。二甲双胍可显著抑制丙酮酸脱氢酶复合物（PDC）部分生成的乙酰辅酶a的生物合成。此外，二甲双胍降低线粒体复合物I的活性，引起ETC的改变。因此，含有NADH的电子不能有效地通过ETC传输，从而降低了NAD⁺水平。与这些研究一致，我们检测到二甲双胍处理的HUVEC细胞中葡萄糖和富马酸盐增加，但NAD⁺减少。TCA循环中间产物的积累可能促进正常上皮细胞丙氨酸和天冬氨酸的生物合成。相反，我们观察到二甲双胍处理的CCA细胞中NAD⁺水平升高，TCA循环中间产物水平下降，这种差异可能源于癌细胞的代谢转化。癌细胞通过有氧糖酵解产生能量，其中无论氧水平如何，胞浆中都会发生高比率的糖酵解和乳酸发酵。鉴于葡萄糖消耗和乳酸生成增加，我们假设二甲双胍治疗促进糖酵解并排出NADH中的电子以将丙酮酸转化为乳酸，从而加重癌细胞中的Warburg效应。众所周知，糖酵解的调节与二甲双胍激活的AMPK密切相关。同样，我们的研究结果表明二甲双胍对CCA细胞的糖酵解有深刻的影响，这为AMPK在二甲双胍治疗CCA细胞的抗癌作用中起重要作用的观点提供了独立的支持。氨基酸的生物合成与TCA循环和谷氨酸代谢密切相关。我们的结果表明，二甲双胍治疗降低了CCA细胞和HUVECs中谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和巴拉宁的含量，表明二甲双胍对非必需氨基酸的合成有显著影响。二甲双胍处理的细胞缺乏底物可能导致谷胱甘肽不足，从而中断氧化应激。我们发现，三种BCAAs在HUVEC细胞中的水平基本没有变化，但在二甲双胍处理的CCA细胞中显著增强。作为必需氨基酸，支链氨基酸不能内源性合成，它们被高度可逆的酶分解代谢，三种支链氨基酸都是底物。因此，三种BCAAs水平的变化趋势相同，幅度相似，而且二甲双胍抑制BCAAs分解代谢酶的表达或活性。因此，我们推测BCAAs在CCA细胞中的积累可能是由于自噬诱导的蛋白质降解。以前的研究已经证明二甲双胍可以显著抑制mTOR，直接导致自噬的激活。与这些工作一致，我们的结果为二甲双胍治疗可能通过激活自噬过程发挥抗癌作用的观点提供了独立的支持。研究表明，支链氨基酸（尤其是亮氨酸）是mTORC1的有效激活剂，这意味着二甲双胍对mTOR信号的负反馈调节。二甲双胍与BCAAs在CCA中的相关性有待进一步研究。先前有报道称二甲双胍治疗可诱导其他几种癌细胞系的细胞周期阻滞。有趣的是，我们观察到二甲双胍处理的CCA细胞中UDP-GlcNAc水平显著升高。据我们所知，这是首次报道二甲双胍的抗癌作用与UDP-GlcNAc有关。众所周知，UDP-GlcNAc是真核生物中大多数细胞表面受体和转运蛋白N-糖基化的共同供体底物。以前的研究表明，含有少量N-聚糖的糖蛋白在对UDP-GlcNAc水平升高的开关样反应中显著上调，例如TbR、CTLA-4和GLUT4，它们介导器官发生、分化和细胞周期阻滞。相反，含有大量N-聚糖的糖蛋白随着UDP-GlcNAc水平的增加而缓慢上调，包括刺激细胞生长和增殖的EGFR、IGFR、FGFR和PDGFR。因此，CCA细胞中UDP-GlcNAc水平的增加可能诱导N-糖蛋白的表面水平的增强，并最终驱动程序阻滞和抑制增殖。二甲双胍与细胞周期阻滞的相关性有待进一步研究。此外，为了尽可能多地鉴定代谢物，我们选择记录细胞中水提取物的溶液核磁共振波谱。值得注意的是，其他强大的核磁共振技术能够在代谢组学分析中提供独特的优势，而高分辨魔角核磁共振技术（HRMAS）为完整组织中单个代谢物的观察提供了一个窗口，这可能有助于阐明二甲双胍在体内对CCA抗癌作用的分子机制。

结论

在这项工作中，我们进行了全面的核磁共振代谢组学分析，以获得二甲双胍治疗对两个CCA细胞系的抗癌作用，并探讨其潜在的分子机制。我们确定了二甲双胍治疗的CCA细胞相对于未治疗对照组的特征代谢产物和显著改变的代谢途径。通过比较二甲双胍对CCA细胞和正常HUVEC细胞代谢产物水平的影响，我们发现二甲双胍能显著促进CAA细胞糖酵解，加重Warburg效应。此外，二甲双胍特异性地增加BCAAs和UDP-GlcNAc，这意味着二甲双胍治疗的CAA细胞发生自噬和细胞周期阻滞。这些结果扩展了我们对二甲双胍对CCA细胞抗癌作用的分子机制的理解，并为二甲双胍在CCA治疗中的临床应用提供了依据。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33330044/

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